通过墨水循环改善生物喷墨打印中的细胞分布均匀性-技术前沿-资讯-生物在线

通过墨水循环改善生物喷墨打印中的细胞分布均匀性

作者：上海睿度光电科技有限公司 2025-01-16T00:00 (访问量:185)

德克萨斯理工大学工业、制造和系统工程系Changxue Xu教授课题组使用MicroFab喷墨打印技术，通过液滴发生设备研究了生物打印过程中有/无墨水循环系统对生物墨水及打印结果中细胞分布的影响，实验表明，打印中墨水循环可明显改善细胞聚集、使细胞分布均匀，打印后细胞均匀分布，在促进细胞存活（培育3天从77%增到92%）和增殖（培育3天从1.7倍增到3.3倍）方面起关键作用，为组织/器官生物制造提供了重要支撑。

正文

增材制造技术的发展使得利用细胞和生物材料制造用于各种生物医学应用的体外培养仿生器官成为可能，基于喷墨技术的生物打印可利用适用于大多数活细胞的喷嘴尺寸和打印分辨率，获得高打印细胞存活率（＞90%），同时其非接触打印、快速固化、高精度和自由曲面制造能力可用于制造复杂生物结构，如皮肤、组织和血管模型。然而，墨水中细胞沉降及其聚集现象导致液滴不稳定、喷嘴堵塞和打印分布不均一，严重影响打印的准确度，因此，本文重点研究了生物打印中有/无生物墨水循环对微球和片状结构中细胞分布的影响，揭示了细胞聚集对打印后细胞分布以及增殖和细胞活力的不利影响，为提高生物喷墨打印的精度和可靠性提供了重要的依据，这对组织/器官生物制造起着至关重要的作用。

▲ 图1 带有生物墨水储液器的喷墨生物打印装置示意图

如图1，使用MicroFab波形发生器连接MJ喷墨喷头（120μm）并向其发送信号，以产生生物墨滴。通过连接在生物墨水储液罐底部和顶部的生物用硅胶管控制墨水循环，流速0.3ml/min，维持细胞分布均匀。

▲ 图2 （a）喷墨打印的液滴生成过程（b）微球包载单个细胞、小细胞聚集体和大细胞聚集体图，比例尺40μm

图2展示了液滴生成过程及打印结果的代表图像，喷墨频率、喷墨喷嘴的移动速度和移动偏移之间进行交叉优化，以打印最佳的生物膜层。采用100Hz的喷墨频率、200mm/min的移动速度和100μm的移动偏移来实现生物打印微球和生物打印线条之间的最佳融合。

▲ 图3 在0.5%（w/v）NaAlg和1×10⁶个细胞/ml的微球内细胞分布和细胞聚集：（a）代表性图像，（b）细胞分布，以及（c）细胞聚集。比例尺：100μm

图3结果证明，有墨水循环系统时，生物打印微球内细胞分布的均匀性得到改善，如图3（a）所示，当无墨水循环时，微球的平均细胞数增加到0.806，因为细胞会沉降从而导致局部细胞浓度和细胞聚集增加；当引入墨水循环时，平均细胞数从 0.255略微增加到0.305，这表明喷墨打印微球内细胞分布的均匀性得到了显著改善。如图4所示，当细胞浓度高时（5×10⁶个细胞/ml），引入生物墨水循环也能抑制细胞的聚集，应用生物墨水循环来促进喷墨打印微球内的细胞分布均匀性也适用于高细胞浓度。

▲ 图4 在0.5%（w/v）NaAlg和5×10⁶个细胞/ml的微球内细胞分布和细胞聚集：（a）代表性图像，（b）细胞分布，和（c）细胞聚集。比例尺：100μm

▲ 图5 含有3T3小鼠成纤维细胞的生物打印片材内细胞分布均匀性改善的结果：（a）生物打印片材（宽：0.5mm和高：1mm）和局部成像（比例尺：100μm）的代表性图像及（b）统计结果

应用生物墨水循环能提高生物打印片材内细胞空间分布的均匀性，图5（a）为生物打印片状结构中细胞分布的影响（随机选择面积为0.5×0.5mm的10个样本）。图 5（b）显示了不同细胞浓度下生物打印片材的相应细胞分布结果，当无墨水循环时，低细胞浓度和高细胞浓度的高标准差反映了细胞聚集程度高、细胞分布不均匀，突出了解决细胞沉积和聚集问题的必要性。

▲ 图6 孵育期有/无墨水循环对（a）细胞分布和（b）细胞活力的影响，（c）细胞纵横比、（d）细胞分布比和（e）细胞活力的统计。比例尺：100μm

图6展示了生物墨水循环对细胞分布及打印后细胞生长、增殖和活力的影响。均匀的细胞分布在细胞数量方面促进细胞增殖，在5×10⁶个细胞浓度、20min生物墨水循环下，细胞孵育三天的活力从95%下降到92%，相比之下，无墨水循环的细胞活力从96%降到77%。细胞死亡通常发生在大细胞聚集体的中心周围，可能是由于外层细胞过厚阻碍了营养物质和氧气的交换，因此细胞聚集体严重影响生物打印质量，生物墨水循环及喷墨打印技术结合，制备均匀的片状结构，改善了细胞分布，促进细胞存活（培育3天从77%增到92%）和增殖（培育3天从1.7倍增到3.3倍）。

结语

本研究揭示了细胞聚集对喷墨生物打印中细胞分布及细胞增殖、细胞活力的影响，并证实墨水循环系统可使细胞分布得到显著改善，为提高喷墨生物打印技术的精度以及生物打印的活力提供了重要依据，这对组织/器官生物制造的成功起着至关重要的作用。

参考文献：

[1] Liu J, Xu C. Improving uniformity of cell distribution in post-inkjet-based bioprinting[J]. Journal of Manufacturing Science and Engineering, 2024, 146(1): 014501.

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